操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：ALK/IGF1R抑制劑（AZD-3463）

英文名稱：AZD-3463

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8072

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

人 LNPEP 基因全長ORF克隆人鐵調(diào)素(Hepc)免疫試劑盒進口、分裝

人 ITIH2 基因全長ORF克隆人鐵蛋白重鏈(FTH)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應

人 GALC 基因全長ORF克隆人鐵蛋白(FE)免疫試劑盒*直銷

人 COL9A2 基因全長ORF克隆人天青殺素/肝素結(jié)合蛋白(AZU/HBP)免疫試劑盒進口、組裝

人 COL10A1 基因全長ORF克隆人天門冬氨酰-tRNA合成(DARS)免疫試劑盒進口、分裝

人 CHGB 基因全長ORF克隆人天門冬氨基轉(zhuǎn)移(AST)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應

人 EPO 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)人糖脂抗體(glycolipid)免疫試劑盒*直銷

人 COPS2 轉(zhuǎn)錄變體1 基因全長ORF克隆人糖盞蛋白免疫試劑盒進口、組裝

人 BPHL 基因全長ORF克隆人糖原化同工MM(GP-MM)免疫試劑盒進口、分裝

人 ARSB 基因全長ORF克隆人糖原化同工II(GP-II)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應

人 PPP3R1 基因全長ORF克隆人糖原化同工BB(GP-BB)免疫試劑盒*直銷

ALK/IGF1R抑制劑（AZD-3463）HCV NS5A抑制劑(Daclatasvir)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  Daclatasvir2 ug pBAD43 pBAD43 低溫運輸，-20℃保存

HIV-1整合酶抑制劑(Dolutegravir)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  Dolutegravir50次 沉淀法miRNA分離試劑盒 miRNA Isolation Kit 4℃保存

3CLpro抑制劑(GC376)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg  GC3762 ug pCMV-Flag-C pCMV-Flag-C 低溫運輸，-20℃保存

HCV NS3/4A protease抑制劑（Simeprevir）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Simeprevir20次 DNA去化試劑盒 DNA Dephosphorylation Kit -20℃保存

β-lactamase抑制劑（Avibactam sodium）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  Avibactam sodium10g  1:10000 Pepsin 1:10000 室溫保存

SAPKs/JNKs激活劑(Anisomycin)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Anisomycin50T 人基質(zhì)金屬蛋白基因PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

influenza A和B病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑（Oseltamivir acid）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  Oseltamivir acid100μL Camptothecin Cell Apoptosis Inducer and Inhibitor -20℃保存

MMP抑制劑（Doxycycline hyclate）  1mL(10mM)|1g|5g|10g  Doxycycline hyclate250mL Citrate Buffer（檸檬酸鹽緩沖液）,0.5M,pH3.0   Citrate Buffer,0.5M,pH3.0   常溫保存

HCV NS3protease抑制劑（Asunaprevir）  1mL(10mM)|1mg|2mg|5mg|10mg|50mg  Asunaprevir5次 TdT加尾法DNA辛標記試劑盒 TdT-Tailing DNA Labeling Kit Series -20℃保存

蛋白和RNA合成抑制劑(Cycloheximide)  1mL(10mM)|200mg|500mg|1g|5g  Cycloheximide2 ug pKC1139 pKC1139 低溫運輸，-20℃保存

5-Deiodinase抑制劑（Iopanoic acid）  1mL(10mM)|100mg  Iopanoic acid細菌L型增菌液 Bacterial L-growing Broth 65g