細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：EGFR2/HER2抑制劑(Mubritinib)

英文名稱：Mubritinib

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7857

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

麥角甾醇

英文名：   Ergosterol

英文別名：   ergosta-5,7,22-trien-3β-ol

CAS登錄號(hào)：   57-87-4

分子式：   C28H44O

氧化槐果堿

英文別名：   Sophocarpidine; Sophocarpine N-oxide; (+)-Oxysophocarpine; (+)-Sophocarpine N-oxide; Oxysophocarpine; Sophocarpidin

CAS登錄號(hào)：   26904-64-3

分子式：   C15H24N2O2

分子量：   364.36

豆甾醇

英文名：   Stigmasterol

英文別名：   Stigmasta-5,22-dien-3beta-ol; 94%; stigmasta-5,22-dien-3-beta-ol; 24-Ethylcholesta-5,22-dien-3beta-ol

CAS登錄號(hào)：   83-48-7

分子式：   C29H48O

漢黃芩素

英文名：   Wogonin

英文別名：   5,7-Dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one

CAS登錄號(hào)：   632-85-9

分子式：   C16H12O5

胡麻屬苷

CAS登錄號(hào)：   117479-87-5

分子式：   Cl7H24O12

分子量：   420.3

分子結(jié)構(gòu)：     

白蠟樹(shù)素

英文名：   Dimethylfraxetin

英文別名：   O,O-dimethylfraxetin；6,7,8-trimethoxycoumarin; 2H-1-Benzopyran-2-one, 6,7,8-trimethoxy

CAS登錄號(hào)：   6035-49-0

分子式：   C12H12O5

芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

英文名：   Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside

英文別名：   Apigenin-7-glucoside; 4H-1-Benzopyran-4-one, 7-(β-D-glucopyranosyloxy)-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)

CAS登錄號(hào)：   578-74-5

分子式：   C21H20O10

異甘草素

英文名：   Isoliquiritigenin

英文別名：   2',4,4'-Trihydroxychalcone

CAS登錄號(hào)：   961-29-5

分子式：   C15H12O4

文多靈

英文名：   Vindoline

英文別名：   Vindoline free base;Bufexamacum; aspidospermidine-3-carboxylicacid,4-(acetyloxy)-6,7-didehydro-3-hydroxy-16-me;thoxy-1-methyl-,methylester,(2-beta,3-beta,4-beta,5-alpha,12-beta,19-alpha)

CAS登錄號(hào)：   2182-14-1

分子式：   C25H32N2O6

白樺脂醇

英文名：   Betulin

英文別名：   Lup-20(29)-ene-3b,28-diol

CAS登錄號(hào)：   473-98-3

分子式：   C30H50O2

羽扇豆醇

英文名：   Lupeol

英文別名：   Fagarasterol

CAS登錄號(hào)：   545-47-1

分子式：   C30H50O

EGFR2/HER2抑制劑(Mubritinib)AO/EB雙熒光染色試劑盒  100T  改良馬丁液體培養(yǎng)基  250ml*20瓶

MDC染色液  2×1ml  2 ug pSTAT1-Luc pSTAT1-Luc 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)  100T  乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基顆粒 Lactose Bile Broth 300ml/袋*10

醋酸洋紅染色液  50ml|100ml  10次 克必隆eTS 超敏PCR法cDNA合成試劑盒  

硼酸洋紅染色液  100ml  50mL Nickel Sulfate Solution（硫酸鎳溶液）,0.5M  Nickel Sulfate Solution,0.5M  常溫保存

肥大細(xì)胞染色液(醛品紅-橙黃G法)  4×20ml|4×50ml  20次 即用型藍(lán)白T載體D型（無(wú)啟動(dòng)子，有MCS） Instant Blue-White Vector T，Type D -20℃保存

肥大細(xì)胞染色液(阿利新藍(lán)沙黃法)  3×50ml  2 ug pMKO.1-puro pMKO.1-puro 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

結(jié)晶紫MES溶液(0.1%,pH6.0)  100ml  酵母浸粉（進(jìn)口） Yeast Extract Powder 250g

臺(tái)盼藍(lán)染色液(1%)  10ml|50ml  1瓶 SP2/0細(xì)胞株 SP2/0 低溫運(yùn)輸和保存

中性紅染色液(0.1%)  100ml  BPL瓊脂 BPL Agar 250g

中性紅染色液(0.5%)  100ml  2 ug pIRES2-AcGFP1 pIRES2-AcGFP1 低溫運(yùn)輸，-20℃保存