細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：MEK1抑制劑(GDC-0623)

英文名稱：GDC-0623

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7921

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

人 HOXA6 基因全長ORF克隆小鼠羥甲基戊二酸單酰輔A還原(HMG-CoAR)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 CSMD2 基因全長ORF克隆小鼠羥甲基戊二酸單酰輔A(HMG-CoA)免疫試劑盒*直銷

人 GRPEL2 基因全長ORF克隆小鼠羥脯(Hyp)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 MXD1 基因全長ORF克隆小鼠前心鈉肽(Pro-ANP)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 HIST1H1A 基因全長ORF克隆小鼠前列腺特異性抗原(PSA)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 RAB4B 基因全長ORF克隆小鼠前列腺酸性(PAP)免疫試劑盒*直銷

人 HIST1H1T 基因全長ORF克隆小鼠前列腺素G/H合1(PTGS1)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 RGS8 基因全長ORF克隆小鼠前列腺素F(PGF)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 ARPC3 基因全長ORF克隆小鼠前列腺素E2合成(PGES)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 NPM3 基因全長ORF克隆小鼠前列腺素E2(PGE2)免疫試劑盒*直銷

人 DLX6 基因全長ORF克隆小鼠前列腺素E1(PGE1)ELISA試劑盒進(jìn)口、組裝

MEK1抑制劑(GDC-0623)MLKL藥理抑制劑(Necrosulfonamide)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  Necrosulfonamide50T 病毒H5亞型PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

CHK1抑制劑(CCT245737)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  CCT2457371 mg JC-1 Fluorescent Probe and Tracer -20℃保存

EGFR抑制劑(AZD3759)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  AZD375950mL Calcium Acetate Solution（乙酸鈣溶液）,0.2M  Calcium Acetate Solution,0.2M  常溫保存

蛋白酶抑制劑(MLN9708)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  MLN970850次 柱式DNA PAGE膠回收試劑盒 Column PAGE DNABACK 4℃保存

E1抑制劑(PYR-41)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  PYR-412 ug pGL4.27[luc2P/minP/Hygro] pGL4.27[luc2P/minP/Hygro] 低溫運輸，-20℃保存

二聚化Smac mimetics，IAPs抑制劑  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg  AZD5582瓊脂培養(yǎng)基H Agar medium H(MacConkey agar) 250g

Nrf-2激活劑(Bardoxolone)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Bardoxolone1瓶 HFL1細(xì)胞株 HFL1 低溫運輸和保存

PAK抑制劑(PF-3758309)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  PF-3758309李氏菌增菌肉湯（LB1） Listeria Enrichment Broth Base 9ml*20支/包

ATM激酶抑制劑(KU-60019)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  KU-6001950U Furin 蛋白 Furin Protease -20℃保存

20S蛋白酶體抑制劑(Epoxomicin)  1mL(10mM)|100ug|1mg|5mg|10mg|20mg  Epoxomicin250mL RNase-Free Tris-HCl Solution（無RNase的Tris-HCl溶液）,1M,pH7.4   RNase-Free Tris-HCl Solution,1M,pH7.4   常溫保存

MDM2抑制劑(NVP-CGM097)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  NVP-CGM0971 管 MG1655大腸桿菌 MG1655 E.coli Strain -80℃保存