操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：Raf激酶和EGFR抑制劑(BGB-283)

英文名稱：BGB-283

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8524

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

大鼠 TNFSF11 基因全長ORF克隆多參數(shù)細(xì)胞周期全周期流式細(xì)胞分析試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF12A 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期G0期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 CX3CL1 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期G1早期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 CD70 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期G1期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF11A 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期G1后期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF11B 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期S早期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 CD27 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期S期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF13B 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期S后期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF17 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期G2期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFRSF21 基因全長ORF克隆動物細(xì)胞周期M期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

大鼠 TNFSF12 基因全長ORF克隆通用型動物細(xì)胞周期（G1/S和G2/M期）同步（SYNCHRONY）處理試劑盒  10次

Raf激酶和EGFR抑制劑(BGB-283)HEF1  蛋白激底物相關(guān)蛋白抗體 規(guī)格: 0.2mlMUC15  粘蛋白15抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-human IgG/PE-Cy7  PE-Cy7標(biāo)記的小鼠抗人IgG 規(guī)格: 0.1ml

HDC  L-組脫羧抗體 規(guī)格: 0.1mlNDUFS1/NADH dehydrogenase (ubiquinone) FeS protein 1 (75kD)  線粒體復(fù)合物NDUFS1蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

CCDC93  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白93抗體 規(guī)格: 0.2ml

phospho-ATF2 (Thr55)  磷酸化活化復(fù)制因子2抗體 規(guī)格: 0.1mlHDAC11  組蛋白去乙?；?1抗體 規(guī)格: 0.1ml

Hrasls3/HREV107  HRAS樣抑制因子3抗體 規(guī)格: 0.2ml

Phospho-HER3 (Tyr1222)  磷酸化HER3受體抗體 規(guī)格: 0.1mlDonkey Anti-human IgG/Cy5  Cy5標(biāo)記的驢抗人IgG 規(guī)格: 0.1ml

EGF  小鼠抗表皮生因子抗體 0.1ml

Mouse Anti-human IgM/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5標(biāo)記的小鼠抗人IgM 規(guī)格: 0.1mlEndomucin  內(nèi)皮粘蛋白EMCN抗體 規(guī)格: 0.2ml

GSK-3 Beta (CT)  葡萄糖合成激-3β抗體 規(guī)格: 0.1ml

StAR/StARD1  促黃體激素誘導(dǎo)蛋白抗體 規(guī)格: 0.2mlCNOT6  細(xì)胞表面趨化因子受體4相關(guān)蛋白6抗體 規(guī)格: 0.2ml