中文名稱：RET激酶抑制劑(AST 487)

英文名稱：AST 487

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7855

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

脫水長(zhǎng)春堿

英文別名：   3',4'-Didehydroisoleurosine

CAS登錄號(hào)：   38390-45-3

分子式：   C46H56N4O8

分子量：   792.96

長(zhǎng)春堿

英文名：   vinblastine

英文別名：   Vincaleukoblastine；VLB

CAS登錄號(hào)：   865-21-4

分子式：   C46H58N4O9

硫酸司巴丁

英文別名：   Siarczansparteiny

CAS登錄號(hào)：   299-39-8

分子式：   C15H28N2O4S

分子量：   332.46

高烏甲素

英文名：   Lannaconitine

英文別名：   Aconitane-4,8,9-triol, 20-ethyl-1,14,16-trimethoxy-, 4-(2-acetylamino)benzoate, (1-alpha,14-alpha,16-beta)

CAS登錄號(hào)：   32854-75-4

分子式：   C32H44N2O8

去甲斑蝥酸

分子量：   186.16

CAS登錄號(hào)：   新品待定

分子結(jié)構(gòu)：     

外觀：   白色粉末

苔黑酚葡萄糖苷

英文名：   Orcinol glucoside

英文別名：   1-O-α-D-glucopyranosyl-3-hydroxy-5-methylbenzene

CAS登錄號(hào)：   21082-33-7

分子式：   C13H18O7

氧代川南亭堿

分子量：   323

CAS登錄號(hào)：   新品待定

分子結(jié)構(gòu)：     

規(guī)格：   20 mg/支

升麻酮醇-3-O-α-L-拉伯糖苷

CAS登錄號(hào)：   256925-92-5

分子式：   C35H52O9

分子量：   616.78

分子結(jié)構(gòu)：     

黃獨(dú)素B

英文名：   Diosbulbin B

CAS登錄號(hào)：   20086-06-0

分子式：   C19H20O6

分子量：   344.36

桑辛素

英文名：   Morusin

英文別名：   4H,8H-Benzo(1,2-B:3,4-B’)dipyran-4-one, 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-8,8-dimethyl-3-(3-methyl-2-butenyl)

CAS登錄號(hào)：   62596-29-6

分子式：   C25H24O6

白綿馬素AA

英文別名：   ,5-Cyclohexadien-1-one,2,2'-methylenebis[6-acetyl-3,5-dihydroxy-4,4-dimethyl-

CAS登錄號(hào)：   3570-40-9

分子式：   C21H24O8

分子量：   404.15

RET激酶抑制劑(AST 487)細(xì)胞脂質(zhì)染色試劑盒  1000T|5000T  250g D- 果糖 D-Fructose   室溫干燥保存

細(xì)胞膜完整性檢測(cè)試劑盒  500T  50T 漢坦病毒Ⅰ型PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

細(xì)胞膜染色試劑CM-Dil  200μl  30µL β-Tubulin小鼠單抗 β-Tubulin Mouse MAb -20℃保存

細(xì)胞膜染色試劑DiO  500μl  2 ug YFP-tubulin YFP-tubulin 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

細(xì)胞膜染色試劑盒(PKH67)  500T  2mL 羧基磁珠 Magnetic beads,Carboxylic 4℃密閉、豎直保存

革蘭氏菌染色鑒定試劑盒(Brown-Brenn)  100次  Brown-Brenn Staining Kit100mL TE Buffer,100X,pH7.4 TE Buffer,100X,pH7.4 常溫保存

革蘭氏菌染色鑒定試劑盒(Brown-Hopp)  100次  Brown-Hopp Staining KitTSA表面接觸皿7.5cm  10個(gè)/包

Taylor改良Brown-Brenn革蘭法細(xì)菌染色試劑盒  100次  1瓶 BIU-87細(xì)胞株 BIU-87 低溫運(yùn)輸和保存

Hoechst33258染色液  10ml|50ml  Hoechst33258 Staining Solution阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI瓊脂）  200g

Hoechst33258染色液(1mg/ml)  1ml|5×1ml  Hoechst33258 Staining Solution(1mg/ml)100U 熱啟動(dòng)Taq DNA聚合 Hot Start Taq DNA Polymerase -20℃保存

Hoechst33342染色液  10ml|50ml  Hoechst33342 Staining Solution250mL Para-formaldehyde-Glytaraldehyde in Bicarbonate Buffer   Para-formaldehyde-Glytaraldehyde in Bicarbonate Buffer   常溫保存

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)