操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：CDK抑制劑（Purvalanol B）

英文名稱：Purvalanol B

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7989

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

人 TMX1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子透明質(zhì)酸(HAase)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 HAUS1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子透明質(zhì)酸(HA)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 RAB40B 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子肽聚糖(PG)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 ZWINT 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子髓磷脂堿性蛋白(MBP)免疫試劑盒*直銷

人 PYCRL 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子髓過(guò)氧化物(MPO)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ATP5O 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子瘦素(LEP)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 CHMP2B 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 VTI1A 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子生長(zhǎng)激素釋放多肽(GHRP)免疫試劑盒*直銷

人 DPCD 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子生長(zhǎng)激素(GH)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 RAB13 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子腎上腺髓質(zhì)素(ADM)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 RGS16 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4(NT-4)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

CDK抑制劑（Purvalanol B）PD-l/PD-Ll相互作用抑制劑(N-deacetylated BMS-202)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  N-deacetylated BMS-202酵母浸粉 Yeast Extract Powder 250g

BCRP抑制劑(KS176)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  KS1761瓶 SMC細(xì)胞株 SMC 低溫運(yùn)輸和保存

NF-κB抑制劑((+)-DHMEQ)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg  (+)-DHMEQ7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基（2015藥典）  250g

TRPP3channel抑制劑(EIPA)  1mL(10mM)|5mg|10mg  EIPA50g 熒光素鈉 Fluorescein Sodium Salt 室溫保存

type II CDK2抑制劑(K03861)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg|50mg  K0386150T 登革熱病毒PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

NAMPT抑制劑(Nampt-IN-1)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Nampt-IN-125g L- 谷鈉 L-Glutamate Sodium    室溫保存

EZH2抑制劑（CPI-169 racemate）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  CPI-169 racemate2 ug pKD4 pKD4 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

PI3K/mTOR抑制劑(PF-04979064)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg  PF-04979064季銨鹽類中和劑管  9ml*20

ATX(autotaxin)抑制劑(HA130)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  HA1301瓶 MCF-7/Adr細(xì)胞株 MCF-7/Adr 低溫運(yùn)輸和保存

5-HT2A反向激動(dòng)劑(Nelotanserin)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Nelotanserin胰化大豆堅(jiān)固綠瓊脂  250g

PI3K抑制劑(SF2523)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  SF2523100mg 核糖核酸 B Ribonuclease B 4℃保存