細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：c-Met抑制劑（EMD-1214063）

英文名稱：EMD-1214063

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7851

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

烏金苷

CAS登錄號(hào)：   新品待定

分子結(jié)構(gòu)：     

規(guī)格：   20 mg/支

純度：   ≥ 98%

告達(dá)亭苷元

英文名：   caudatin

英文別名：   (3beta,12beta,14beta,17alpha)-12-[[(2E)-3,4-Dimethyl-1-oxo-2-pentenyl]oxy]-3,8,14,17-tetrahydroxypregn-5-en-20-one

CAS登錄號(hào)：   38395-02-7

分子式：   C28H42O7

青陽(yáng)參苷元B

英文名：   Qingyangshengenin B

CAS登錄號(hào)：   新品待定

分子式：   C29H44O6

分子量：   488.66

青陽(yáng)參苷元A

英文名：   Qingyangshengenin A

CAS登錄號(hào)：   新品待定

分子式：   C29H38O7

分子量：   498.61

決明蒽醌

英文名：   Obtusifolin

英文別名：   2,8-Dihydroxy-1-methoxy-3-methyl-9,10-anthracenedione

CAS登錄號(hào)：   477-85-0

分子式：   C16H12O5

山麥冬皂苷B

英文名：   Liriopesides B

英文別名：   25(S)-ruscogenin-1-O-β-D-fucopyranoside-3-O-α-L-rhamnopyranosy

CAS登錄號(hào)：   182284-68-0

分子式：   C39H62O12

3-異倒捻子素

英文別名：   3,4-dihydro-5,9-dihydroxy-8-methoxy-2,2-dimethyl-7-(3-methylbut-2-enyl)pyrano[3,2-b]xanthen-6(2H)-one

CAS登錄號(hào)：   19275-46-8

分子式：   C24H26O6

分子量：   410.46

β-倒捻子素

英文名：   Beta-mangostin

英文別名：   1,6-Dihydroxy-3,7-dimethoxy-2,8-bis(3-methyl-2-butenyl)-9H-xanthen-9-one;1,6-Dihydroxy-3,7-dimethoxy-2,8-bis(3-methyl-2-buten-1-yl)-9H-xanthen-9-one

CAS登錄號(hào)：   20931-37-7

分子式：   C25H28O6

梭砂貝母堿

英文名：   Hupehenine

英文別名：   Cevane-3,6-diol(3β,5α,6β,17β)

CAS登錄號(hào)：   98243-57-3

分子式：   C27H45NO2

左旋肉堿

英文名：   L-carnitine

英文別名：   - CARBOXY-N,N,N-TRIMETHYL-2-PROPEN-1-AMINIUM CHLORIDE;

CAS登錄號(hào)：   541-15-1

分子式：   C7H15NO3

人參皂苷CK

英文別名：   20(S)-Ginsenoside C-K；(20S)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)dammara-24-ene-3β,12β-diol

CAS登錄號(hào)：   39262-14-1

分子式：   C36H61O8

分子量：   621.88

c-Met抑制劑（EMD-1214063）oechst 33258染色液(即用型)  10ml|50ml  20L 超快核酸電泳液干粉  SuperBuffer-2 常溫

Hoechst 33342/PI雙染試劑盒  100T  Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit2 ug pGAPZα A pGAPZα A 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

Hoechst 33342染色液  10ml|50ml  腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（顆粒）（2015藥典）  250g

碘化丙啶PI染色試劑盒  100T  Cell Apoptosis Detection Kit(PI)1瓶 CHO細(xì)胞株 CHO 低溫運(yùn)輸和保存

即用型DAPI染色液  10ml|50ml  L-半鹽酸鹽 L- Cysteine hydrochloride 0.04g/支*5

溴化乙錠EB染色試劑盒  100T  Cell Apoptosis Ethidium Bromide Detection Kit500U -DNA糖基化 Uracil DNA Glycosylase（UDG） -20℃保存

EB染色液  100T  50mL Potassium Acetate Solution(乙酸鉀溶液）,1M,pH7.5   Potassium Acetate Solution,1M,pH7.5   常溫保存

細(xì)胞核染料PI染色液(即用型)  10ml|50ml  10塊 LB平板培養(yǎng)基（LB-Amp平板） LB Petri Dish 低溫

死細(xì)胞核7-AAD染色試劑盒  100T  Cell Apoptosis 7-AAD Detection Kit2 ug pPIC 3.5K pPIC 3.5K 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

碘化丙啶  10mg|50mg|100mg  Propidium Iodide醇-雙岐桿菌鑒定  20支

Propidium Iodide染色液(PI,碘化丙啶)  100T  2 ug pBMN-Z pBMN-Z 低溫運(yùn)輸，-20℃保存