細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱(chēng)：CA IX和CA XII抑制劑（U-104）

英文名稱(chēng)：U-104

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8439

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

大鼠 TMBIM6 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅲ型前膠原C端肽(PⅢCP)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

大鼠 SDHB 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

大鼠 FDPS 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

大鼠 LOC100134871 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠3氧代5α類(lèi)固醇4脫氫2(SRD5A2)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

大鼠 RPL3 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠3-硝基酪(3-NT)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

大鼠 SH3BGRL3 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠3-羥基-3-甲基戊二酰輔A合(HMGCS)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

大鼠 PPIA 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠3-O(3-OMD)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

大鼠 CKS1L 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅱ型膠原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

大鼠 PSME1 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

大鼠 H2AFZ 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

大鼠 BTF3 基因全長(zhǎng)ORF克隆大鼠26S蛋白體(26S PSM)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

CA IX和CA XII抑制劑（U-104）100U Therminator II DNA 聚合 Therminator II DNA Polymerase -20℃保存

500mL Phosphate Buffer，0.2M, pH9.5   Phosphate Buffer，0.2M, pH9.5   常溫保存

100次 DNA快速連接試劑盒 Rapid DNA Ligation Kit -20℃保存

2 ug pOTB7 FKBP4 pOTB7 FKBP4 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

3%NaCl  20支

1瓶 V79細(xì)胞株 V79 低溫運(yùn)輸和保存

4次 大提柱式細(xì)菌DNAout Maxi Column Bacterial DNAOUT 常溫保存(需要-20℃保存)

2 ug pET-12a pET-12a 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

酸性肉湯 Acid Borth 250g

1瓶 293 001B細(xì)胞株 293 001B 低溫運(yùn)輸和保存

96支 200 μL RNase-free 黃吸頭（盒裝）  常溫