操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：FGFR抑制劑(FGFR-IN-1)

英文名稱：FGFR-IN-1

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8542

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

大鼠 CAR9 基因全長ORF克隆純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒  50次

大鼠 SOST / Sclerostin 基因全長ORF克隆細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒  50次

大鼠 RBP4 基因全長ORF克隆精液組分氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒  50次

大鼠 CD155 / PVR 基因全長ORF克隆真/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法  50次

大鼠 PCSK9 基因全長ORF克隆定量檢測試劑盒  

大鼠 MET 基因全長ORF克隆動物組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒  50次

大鼠 KIM1 / TIM1 / HAVCR1 基因全長ORF克隆植物氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法  50次

狗 VEGFA 基因全長ORF克隆定量檢測試劑盒  

狗 TNFa 基因全長ORF克隆純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測定試劑盒  20次

狗 KIM1 / TIM1 基因全長ORF克隆純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）初級熒光測定試劑盒  20次

pCMV / hygro (C端FLAG標(biāo)簽) 陽性對照載體膜電位依賴性純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測定試劑盒  20次

FGFR抑制劑(FGFR-IN-1)phospho-PKA R2 (Ser96)  磷酸化蛋白激A受體2α亞基抗體 規(guī)格: 0.1ml

AMPK alpha 1/PRKAA1  苷單磷酸活化蛋白激α1抗體 規(guī)格: 0.1ml

Bcl-6/5  原基因Bcl-6抗體 規(guī)格: 0.2mlFCAR/CD89  免疫球蛋白A Fc段受體1抗體 規(guī)格: 0.1ml

SMC6  染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白6抗體 規(guī)格: 0.2ml

TAF12  TATA框結(jié)合蛋白關(guān)聯(lián)因子12抗體 規(guī)格: 0.1ml

CIKS  核因子NFκB激活蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

JNK3/MAPK10  氨基末端激3抗體 規(guī)格: 0.1ml

C10orf93  10號染色體開放閱讀框93抗體 規(guī)格: 0.2mlCAMK2D/CaMKII delta  鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激2D(CaMKIIδ) 規(guī)格: 0.2ml

KCNH1/EAG1  鉀離子通道蛋白EAG1抗體 規(guī)格: 0.1mlABI3BP  ABI基因家族成員3結(jié)合蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Goat Anti-Guinea pig IgG/Alexa Fluor 350  Alexa Fluor 350標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

DFFB  DNA斷裂因子抗體（蛋白激活脫氧核糖核酸） 規(guī)格: 0.2mlphospho-MCAM(Tyr641)  磷酸化黑色素瘤細(xì)胞粘附分子CD146抗體 規(guī)格: 0.1ml