產(chǎn)品參數(shù)：
| 中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品貨號 | | MTT檢測試劑盒 | MTT Assay Kit | 500次 | BJ-01X6322 |
MTT廣泛用于檢測細胞生長，其原理是MTT可以被活細胞線粒體內的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結晶，而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細胞的活力，細胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。 商品詳細介紹： 產(chǎn)品特點：
1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。
2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復性好。
3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個96孔細胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。
4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。
儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。
使用方法：
下面操作是檢測細胞毒性的試驗，其他應用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎稍作修改即可，故不再贅述。
㈠、接種細胞
1．按常規(guī)消化法消化匯合的單層細胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。
2．200g離心5分鐘收集細胞沉淀。
3．用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，制備成單細胞懸浮液并計數(shù)。
4．將細胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。
5．將足夠量的細胞懸液轉移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。
6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞，則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細胞加在孔的正中，否則細胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。
7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照(用于測OD時調零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應對第11 列反應的影響。
8．按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細胞進入指數(shù)生長期。
㈡、藥物處理
9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細胞-藥物的對照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。
13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細胞的時間，由用戶自己決定。
14．處理結束后去除第2 到第11列(共10列，均含細胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。
15．每天換培養(yǎng)使細胞數(shù)量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。
㈢、存活細胞計數(shù)
16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。
17．小心吸棄孔內培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，最好盡可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結晶物充分溶解。
19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
?注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照)調零。
20．計數(shù)同樣處理的各次重復的平均值。
21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進作用的則斜率加大。 |
實驗報告： 一、分離與培養(yǎng)： 1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小； 2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置； 3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化； 4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)； 二、免疫熒光鑒定： 1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min； 2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min； 4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜； 5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h； 6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。 培養(yǎng)操作步驟 ： 1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）； 3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時； 4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中； 5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。
實驗要點及說明：
1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法； 2．所使用的蓋玻片應該為優(yōu)質玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理； 3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕； 4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率； 5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。 操作要點： 1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。 2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。 3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。 4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。 5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。 6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。 血管緊張素1轉換酶抑制劑抗體 拮抗凋亡轉錄因子抗體 α-1抗胰 ATP結合蛋白家族6抗體 三磷酸腺苷結合盒亞家族G1抗體 脂聯(lián)素受體2抗體 ANGEL1蛋白抗體 ANGEL2蛋白抗體 ANKLE2蛋白抗體 睪丸特異性錨樣蛋白1抗體 錨蛋白重復結構域蛋白13B抗體 錨蛋白重復結構域蛋白20A1抗體 錨蛋白重復結構域蛋白20A3抗體 錨蛋白重復結構域蛋白22抗體 錨蛋白重復結構域蛋白50抗體 BC-020(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2 BC-021(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2 BC-022(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2 BE(2)-M17(人神經(jīng)母細胞瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 BGC-803(人胃癌細胞) 5×106cells/瓶×2 C918(人眼脈絡黑色素瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 CAL-27(人舌鱗癌細胞) 5×106cells/瓶×2 LS 180(人結腸腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2 CNE-2Z(人鼻咽癌細胞) 5×106cells/瓶×2 MTT檢測試劑盒COLO 201(人結直腸腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2 CW-2(人結腸癌細胞) 5×106cells/瓶×2 CRT(人神經(jīng)膠質瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 D283 Med(人腦髓母細胞瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 EA.hy926(人臍靜脈細胞融合細胞) 5×106cells/瓶×2 ECV-304(人臍靜脈內皮細胞) 5×106cells/瓶×2 EJ(人膀胱癌細胞) 5×106cells/瓶×2 H-97(人高轉移肝癌細胞) 5×106cells/瓶×2 |
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