1. 注意事項：

1.1. 欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 %致密度。

1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3. 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP flon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。 1.4. 冷凍保存之細胞濃度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。

細胞冷凍保存：
2. 材料： 2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)

3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。

3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。