可用直接培養(yǎng)法檢測細胞培養(yǎng)箱內(nèi)的支原體污染。
培養(yǎng)基準(zhǔn)備： 基本配方為Difco PPLO broth（60%），馬血清（20%），15%酵母膏溶液（10%），10x儲存液（10%）。由于培養(yǎng)時間長，可加50u/ml青霉素至10x儲存液 或加入乙酸t(yī)uo（1：2000）至培養(yǎng)基中以防止其他細菌的污染。 10x儲存液（1升）： 稱取50克葡萄糖，10克L-鹽酸精氨酸溶于1升蒸餾水中。用0.22μm無菌過濾膜過濾除菌，分裝100ml至瓶中，-70℃保存。 液體培養(yǎng)基（1升）： 稱取21克Difco PPLO broth，0.02克酚紅于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解。滅菌121℃15分鐘滅菌。待溫度降低至室溫后于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血 清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解凍的10x儲存液，混合均勻后分裝至已滅菌的有蓋螺旋試管中，10ml/管。4℃保存，保存期限為1個月。 固體培養(yǎng)基： 稱取21克Difco PPLO broth，0.02克酚紅，15克Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解。121℃15分鐘滅菌，放入50℃水浴中，待溫度降至50℃時于無菌超凈臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml 15%酵母膏溶液及解凍的10x儲存液，混合均勻后倒入60x15mm無菌培養(yǎng)皿中，5ml/皿。保存于4℃，期限為1個月。 步驟：取1ml細胞培養(yǎng)液或0.2ml細胞懸浮液接種于液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)2周，觀察是否有渾濁或pH變化。培養(yǎng)一 周及兩周后，分別取0.1ml液體培養(yǎng)液涂于瓊脂平板上，倒置于厭氧缸中，37℃培養(yǎng)至少3周，持續(xù)觀察是否有支原體菌落出現(xiàn)。另取1ml細胞培養(yǎng)液或 0.2ml細胞懸浮液涂于瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)3周，持續(xù)觀察是否有支原體菌落出現(xiàn)。另作正負對照組，正對照為Acholeplasma laidlawii（ATCC 23206）與M. arginini（ATCC 23838）。負對照組為待測細胞的新鮮培養(yǎng)液。 結(jié)果判斷：支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周增殖后再培養(yǎng)于瓊脂平板上，至少培養(yǎng)3周后才能斷定是否有支原體 污染。所以總個測試要5周才知道正確結(jié)果。典型的支原體菌落是荷包蛋形，是由于支原體網(wǎng)瓊脂下層生長所致，為無色透明菌落，大小約為10-55μm 。但是并非所有支原體都是荷包蛋菌落，有些是圓形或類似黏菌類形態(tài)。區(qū)分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自瓊脂平板上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)一周后再接種入瓊脂平板，細胞和菌落則不會生長。