ELISA試劑盒（一） PCR的基本原理 PCR擴增放大DNA的基本原理和基本過程如下：將含有所需放大分析序列的DNA加熱變性為單鏈，然后加入一對與所放大分析的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左端引物和右端引物。這對引物必須將所需放大分析的DNA片段包括在其范圍內。引物可根據已知DNA序列用DNA自動合成儀合成，一般只需20個堿基對，但不能更少，否則在68℃就不能保持與DNA單鏈的互補結合，在有DNA多聚酶和4種三磷酸脫氧核苷（dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dNTP）存在下，以放大分析的DNA單鏈為模板，按5′到3′方向將引物延長，自動合成新的DNA鏈，使DNA重新變成雙鏈。因此，在反應中左、右引物不僅起指導作用，而且起到特異性限制放大合成DNA片段范圍大小的作用。將合成的DNA雙鏈再次加熱變性，繼續(xù)重復以上的DNA多聚酶反應，左、右引物之間這段DNA的量就可成指數倍數增加。如重復進行這一反應n次，則從理論上講，PCR放大的DNA倍數就為2n倍，這樣DNA的量就可在數小時內特異地獲得幾十萬倍的放大。T4DNA多聚酶和大腸桿菌DNA多聚酶I的klenow片段都可用于PCR，但比較試驗的結果顯示T4放大產生的DNA與模板一致，而用klenow片段放大的產物內除含有與模板一致的DNA外，還混有非特異的低分子片段，因而T4比klenow更適用于PCR。1988年Erlich等從耐高溫的水生嗜熱菌（Thermus aquaticus）中提取了一種簡稱為Taq的耐高溫DNA多聚酶。由于Taq多聚酶幾乎不受加熱變性的影響，因而用這種酶進行PCR省去了每次加熱變性后重新加入DNA多聚酶的步驟，使重復反應能連續(xù)進行。

（二） PCR的特點
1．敏感 由于PCR能將一段DNA分子特異地放大約100萬倍，因而極為敏感。PCR可用于檢測DNA含量極微的標本（1ng DNA），甚至可將單根頭發(fā)絲中所含的單一分子DNA放大后進行檢測。
2. 特異 PCR不僅敏感，而且特異。據報道，將PCR放大后的DNA克隆作序列分析，結果表明，PCR放大的DNA序列與原模板DNA序列一致。
3. 簡易快速 PCR可用于直接檢測粗制的DNA標本，如細胞裂解液、血細胞DNA提取液，省去了對標本中檢測DNA的精制純化過程。PCR在一天內即能完成，如尚需作電泳分析、雜交或序列分析等，一般也可在1～3天內完成。
4. 可檢測固定包埋的病理標本或部分DNA降解標本 因為PCR并不要求所放大的DNA為完整的大分子，所以PCR的另一特點是可用于檢測已用福馬林固定或石蠟包埋過的病理組織標本或只有5μm薄的切片，也能用于檢測已部分降解的DNA標本。
5. 直接作序列分析 PCR可提供足夠量的特異DNA作序列分析，省去了以往必須克隆后再作序列分析的過程。在PCR引物上事先用32P作末端標記，放大后的DNA可直接作Maxam-Gilbert序列分析，或用雙脫氧核苷酸終端法作序列分析。
6．可放大RNA PCR也能對RNA或cDNA進行放大，有些外顯子散在分布在一段很長的DNA中，因而難以將整段DNA大分子放大和作序列分析，但如用mRNA作為模板，就可將外顯子集中，一次就能用PCR完成對外顯子的放大和序列分析。
7．無放射性 PCR放大作用本身具有特異性，因而放大后只要用電泳測定到相應量和大小的DNA片段，就能證明標本中存在所檢測的DNA序列。由于PCR放大的DNA量足以使肉眼就能對電泳后經溴化乙錠染色的DNA條帶進行觀察或攝影，因而PCR可作為一種不用同位素的非放射檢測方法，易于在臨床檢測中推廣。

需要指出的是，上述的PCR對DNA病毒的診斷顯示了很高的敏感性，操作亦很簡單，易于應用。但對RNA病毒的診斷，就比較復雜，在進行PCR之前，首先應進行RNA的分離，隨后作反轉錄，即在反轉錄體系中加入一條與mRNA多聚A互補的多聚T作引物，反轉錄與mRNA互補的cDNA鏈，作為后續(xù)實驗的檢測物，此即為檢測RNA病毒用的RT-PCR。

ELISA試劑盒