蛋白質(zhì)純化親和層析法

    儀器設(shè)備：

    親和層析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm)

    分劃收集器 (另需準(zhǔn)備干凈試管約25 支)

    藥品試劑：

    金屬螯合親和層析膠體 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL

    ◆ 在洋菜膠粒上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和的。

    Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)

    ◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。

    Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

    Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

    方法步驟：

    1) 親和層析膠體1 mL 已經(jīng)裝填在管柱內(nèi)，成為一淡藍(lán)色膠柱。請(qǐng)把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，準(zhǔn)備注入樣本。

    2) 除去膠面上方的緩沖液，并取出樣本 (IEX) 使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒入膠體中，同時(shí)收集流出液每管2.5 mL。

    3) 待樣本全部進(jìn)入膠體后，關(guān)閉出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打開出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。

    4) 接著以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集各分劃。

    5) 所有分劃均定量蛋白質(zhì)并測(cè)定酶活性，收集酶活性zui高的數(shù)個(gè)分劃，共得 _______ mL (AF)，保留100 μL 以供分析。