WHO對HIV診斷試劑的評價
　 1998年，為向其成員國提供HIV實驗室診斷方面的建議，世界衛(wèi)生組織AIDS規(guī)劃署(GPA)啟動了評價商品化HIV抗體診斷試劑的計劃，目前也涵蓋了對抗原試劑及抗原／抗體試劑的評價。該計劃對一系列商業(yè)化診斷試劑的評價結果，為衛(wèi)生部門負責人有針對性地選擇診斷試劑提供了參考，同時也為診斷試劑的評價提供了標準。截至目前，所評價的試劑包括血清／血漿抗體檢測試劑、快速檢測(S／R)試劑、全血快速檢測試劑、尿液／唾液檢測試劑及抗原／抗體檢測試劑。自1998年GPA啟動商品化HIV診斷試劑評價計劃至今，已發(fā)布6份評價報告，評價的商業(yè)化試劑有63種之多，其中包括ELISA試劑、S／R試劑和WB試劑，檢測的樣本包括血清、血漿、全血、唾液和尿液等。

一、所評價的試劑以及所用的樣品

評價報告中所使用的試劑均為目前廣為應用的商品化試劑，由商無償提供。不同的診斷試劑檢測樣本不同，針對診斷試劑檢測樣本的要求選擇相應的評價樣品，主要包括血清／血漿樣本、全血樣本、唾液樣本和尿液樣本。

1．血清／血漿樣品的選擇

WHO評價過的檢測血清／血漿樣本的試劑有ELISA抗體試劑、S/R試劑和ELISA抗原／抗體試劑，不同原理的試劑在樣本選擇方面略有不同。

ELISA抗體試劑和S／R試劑在樣本選擇上基本相同，所用樣品主要由三部分組成：WHO血清盤、陽轉系列血清盤和HIV-1 O型血清，其中，HIV-1 O型血清不是必須選擇的。以WHO于1998對人類血清HIV抗體檢測試劑評價為例，ELISA抗體試劑和S／R試劑所用的樣品*相同。WHO血清盤包括595份血清樣品，分別來自不同地區(qū)，包含不同亞型，其陽性與陰性樣品比例約為1：2，具體如表17．4所示。8個陽轉系列血清盤購自美國BBI(Boston Biomedica Inc)公司，其編號分別為PRB 904、PRB909、PRB 911、PRB 912、PRB914、PRB 916、PRB 917和PRB 918，為8個不同患者不同時期的系列陽轉血清。6份HIV-l O型血清經線性免疫分析試驗進行確證，并用HIV-1 O型及M型特異性引物進一步確認。WHO血清盤及陽轉系列血清盤應用于所有評價試劑，而HIV-1 0型血清僅用于評價能檢測HIV-1 O型的試劑盒。

ELISA抗原／抗體試劑的樣品選擇與上述兩者略有差別，在WH0血清盤及陽轉系列血清盤的選擇原則上，三者無明顯區(qū)別，除上述兩種評價樣品外，抗原／抗體試劑評價樣品還有操作血清盤，以2004年wHO對抗原／抗體試劑的評價報告為例，操作血清盤購自：BBI，包括一套由不同滴度抗HIV-1抗體血清組成的抗體血清盤和一套由不同滴度p24抗原血清組成的抗原血清盤，前者包括25份血清，后者包括19份血清，血清WB及抗原檢測結果由BBI提供。

2．全血樣品的選擇

全血試劑評價樣品包括三部分：WHO全血血樣品盤、其對應的血清盤和BBI陽轉系列血清盤。以WHO 2000年對全血診斷試劑的評價為例，250份全血樣品收集于ED-TA抗凝管中，同時收集了與其對應的血清樣品，250份樣品中，170份為抗HIV-1陰性，80份為陽性。8個陽轉系列血清盤購自美國BBI公司。

3．尿液及唾液樣品的選擇

尿液及唾液樣品包括兩部分：WH0尿液或唾液樣品盤及其對應的血清樣品。因唾液及尿液試劑不能檢測血清樣品，因此選擇的樣品不包括BBI陽轉系列血清盤。以WHO 2002年對尿液及唾液診斷試劑評價為例，介紹樣品選擇及預處理。

1)尿液樣品：WHO共收集了300份尿液樣品及其對應的血清樣品，其中，93份為HIV陽性，207份為HIV陰性。先將新鮮的尿液收集至無菌容器中，然后無菌分裝至聚丙烯螺口管中，不添加防腐劑，于2～8℃保存。所有樣品檢測前200g離心1min，然后轉移至無菌管中。所有血清樣品于一30℃凍存，凍融1或2次。

2)唾液樣品：WH0共收集了222份唾液樣品及其對應的血清樣品，其中，75份為HIV陽性，147份為HIV陰性。根據(jù)不同唾液診斷試劑的要求對樣品進行預處理。血清樣品保存方式與尿液對應血清樣品相同。

二、實驗室操作以及參比試劑的選擇

所有檢測均嚴格按試劑說明書操作，通常評價一類試劑的所有實驗由一人操作完成，除WB以外的其他試劑，對一份樣品若*次檢測結果為陽性，則對該樣品重復檢測一次，若兩次結果不一致，再重復一次實驗，以三次檢測中兩次相同的結果作為該樣品檢測結果，若三次檢測結果各不相同，則將結果記為不確定。由于陽轉系列血清價格昂貴，對陽轉系列血清的檢測只進行一次。對ELISA檢測結果將根據(jù)試劑要求用酶標儀讀取數(shù)據(jù)。S／R及WB試劑檢測分別由三人獨立地判定結果，以結果相同的兩次作為zui終結果，若三人判定結果都不相同，則將結果記為不確定。

在待評價試劑檢測前，先用參比試劑對評價用樣品進行檢測。在所有WHO HIV診斷試劑評價報告中，所用的參比試劑均為血清／血漿的檢測試劑。在血清／血漿樣品診斷試劑的評價中，參比試劑的檢測樣品與待評價試劑的相同；而在其他類型樣品(全血、尿液、唾液等)的診斷試劑評價中，參比試劑的檢測樣品為其他類型樣品所對應的血清／血漿樣品。

參比試劑包括兩種類型：初篩試劑和確證試劑。初篩試劑一般為ELISA診斷試劑，至少應包括兩種試劑(有時用確證試劑替代，如對HIV-2陽性樣品的檢測)；確證試劑一般為WB試劑和(或)LIA試劑，對于HIV-1陽性樣品一般只需一種確證試劑，而對于HIV-2陽性樣品則需三種確證試劑，來區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染。

以S／R診斷試劑評價為例。S／R試劑檢測樣品對應的血清／血漿中，所有HIV陰性及HIV-1陽性樣品先經兩種ELISA診斷試劑篩查，兩種診斷試劑為VironostikaHIV Uni-Form II plus O(Organon Teknika)和the Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Be-hringwerke AG)，兩種試劑檢測均為陰性，則認為其為陰性，若任一試劑檢測為陽性，則用相同試劑雙份復試，若任一試劑或兩試劑重復仍為陽性，則用免疫印跡試驗進行確證，確證試劑為InnoLIA HIV(Innlgenetics)。對于HIV-2陽性樣品，為了區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染，先用兩種wB試劑對其進行檢測，兩種試劑為West-ern Blot HIV-1(WB HIV-1)[GenelabsDiagnostics，HIV Blot，(version 1．2)]和NEWLAV BLOT II(WB HIV-2)(SanofiDiagnostics Pasteur)，若兩種檢測試劑均為陽性或結果不確定，則再用Pepti-Lav 1+2(Sanofi Diagnostics Pasteur)進行確證。若WB結果中出現(xiàn)兩條env條帶，無論有無gag、pol條帶，結果都為陽性；若WB結果中無任何條帶為陰性；其他檢測結果為不確定。參比試劑檢測不確定的樣品，在試劑評價中不予應用。

三、評價的技術指標

WHO HIV體外診斷試劑的評價指標有靈敏度、特異性、陽性預期值、陰性預期值、可信限、δ值、重復性，前文已做了詳細介紹，不再贅述，僅就其特殊的評價指標做簡要介紹，包括陽轉系列血清相對敏感性系數(shù)、操作血清檢測靈敏度、結果判定變異度。

1．陽轉系列血清相對敏感性系數(shù)

除尿液及唾液檢測試劑外，其他試劑都對BBI陽轉系列血清進行了檢測，以參比試劑對陽轉系列血清檢測結果作為對照，WH0選擇Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Behringwerke AG)作為參比試劑，對每一陽轉血清盤，Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus檢出的*份系列血清定為0，將待評價試劑檢測結果與其作對比，確定待評價試劑檢出的*份系列血清與參比試劑的0血清的位置關系。對任一陽轉血清盤而言，若待評價試劑檢測出*份為陽性的樣品的位置在參比試劑的O血清位置前2位，則該待評價試劑檢測該轉血清盤的相對敏感性系數(shù)為一2。反之，若在參比試劑的0血清位置后3位，則相對敏感性性系為+3。如此類推，對全部陽轉血清盤而言，待評價試劑的陽轉血清相對敏感性系數(shù)為所有單獨的相對敏感性系數(shù)的均值，并計算95％可信限，以此來評價試劑對窗口期樣品的檢測能力，數(shù)值越小，試劑越靈敏。

2．操作血清檢測靈敏度

為評價HIV Ag／Ab試劑對不同滴度抗原及抗體血清的檢測能力，在HIV Ag／Ab試劑評價中引入了操作血清盤檢測。操作血清盤有兩種：抗體操作血清盤和抗原操作血清盤，分別由不同滴度抗體和p24抗原的血清組成。用待評價Ag／Ab試劑分別檢測抗體及抗原操作血清盤，檢測結果與。BBI提供的抗體wB及抗原試劑檢測結果做比較，得出待評價試劑檢測操作血清盤的靈敏度。

3．結果判定變異度

當試劑檢測結果不是由儀器而是由操作者人為讀取時，不同操作者讀取的結果可能存在差異。如WB及S／R試劑檢測結果的讀取，此情況下，結果的讀取通常由三人獨立完成，zui終結果為兩人判斷相同的結果，若三人結果都不同，則結果為不確定。結果判定變異度為結果判定不一致的血清占總血清數(shù)的百分比：結果判定變異度=結果判斷不一致血清/總血清數(shù)100％

4．附加分析

除上述評價指標外，WHO還制定了一套評分系統(tǒng)，由實驗操作者對試劑滿意度、試劑的操作簡便性、應用于小實驗室的可行性等進行評估。

四、WHO評價試劑的具體內容

WHO對HIV診斷試劑的評價結果以圖表的形式列出，主要包括以下幾方面的內容：①試劑的一般特性；②待評價試劑與參比試劑結果比較；③操作方面的特點；④試劑應用的簡便性及應用于小實驗室的可行性；⑤陽轉系列血清檢測結果比較；⑥操作血清盤檢測結果比較(HIV Ag／Ab試劑)。

1．試劑的一般特性

試劑的一般特性包括以下幾個方面：①試劑商及產地；②試劑類型，按試劑原理分類，如雙抗原夾心ELISA、免疫層析試劑；③試劑、原料，如包被抗原或抗體類型，是重組抗原還是合成抗原，是HIV哪一段的抗原，是單克隆抗體還是多克隆抗體，針對HIV哪一段抗原的抗體；④固相支持物的類型，如ELISA 試劑一般為12×8的微孔板條；⑤檢測樣本的類型為血清／血漿、全血、尿液或唾液等；⑥每個試劑盒所包含的反應數(shù)；⑦批號及失效日期；⑧儲存時間及條件；⑨每一反應所需樣本量；⑩檢測一次所需時間及處理的樣品量；⑨結果讀取方式，如wB試劑為肉眼讀取，ELISA為分光光度計讀取并注明波長；⑥每人份的市場指導價。

2．待評價試劑與參比試劑結果比較

即以參比試劑檢測結果作為標準來評價待評價試劑，其評價指標包括以下幾方面：①靈敏度及靈敏度95％可信限；②特異性及特異性95％可信限；③不確定結果百分率；④結果判定變異度；⑤陽性預期值；⑥陰性預期值。

3．試劑盒操作方面的特點

主要包括以下幾方面：①試劑盒的大小(寬-長-高)；②儲存條件；③反應條件；④反應終止后的穩(wěn)定性；⑤試劑盒中各組分開封后的穩(wěn)定性及儲存條件，如ELISA試劑盒中的微孔板條、陰陽性對照、樣品稀釋液、酶結合物等；⑥每次實驗每一試劑盒所能檢測的zui大和zui小樣品數(shù)；⑦每次檢測中所需的對照及其數(shù)量；⑧每次檢測所需時間；⑨試劑盒未提供但檢測所需的儀器設備；⑩結果判斷法則，包括cut-off值計算公式；⑥灰區(qū)或無效結果的判定。

4．操作者對試劑盒的總體評價

WHO制定了一套評分系統(tǒng)，由實驗操作人員對試劑盒做出總體評價，主要包括以下幾方面：①試劑盒操作步驟，1～2步為6分，3～5步為3分，>5步為1分；②試劑盒說明書情況，“好”為2分，“需改進”為1分；③試劑盒及其組分的包裝及標簽，“好”為2分，“需改進”為1分；④總分，上述三項分數(shù)之和；⑤操作者對試劑盒的建議。評分越高，操作者對試劑盒的評價越高。

5．操作簡便性分析  

WHO對試劑盒操作的簡便性分析也制定了一套評分系統(tǒng)，以ELISA HIV Ag／Ab試劑為例，主要包括以下幾方面：①實驗中需操作者準備的試劑、酶標板條、底物、洗液、酶標抗原、稀釋血清，不需準備為1分，需準備為0分；②試劑盒中組分開封或稀釋后的穩(wěn)定性，標明開封或稀釋后有效期的為1分，開封或稀釋后不穩(wěn)定的為0分，試劑盒中的每一組分作為一項，如酶標版條、樣品稀釋液、陰陽性對照等；③試劑盒未提供但檢測中需要的設備或試劑，如加樣排槍、樣品稀釋管、終止液等，不需準備為1分，需要準備為0分；④操作者對試劑盒總體評價的總分；⑤總分，上述4項得分的綜合；⑥結論，<20分為不簡便，≥20分而≤25分為簡便，>25分為非常簡便。

6．應用于小實驗室的可行性

WH0制定了一套評分系統(tǒng)來評價試劑是否適用于小實驗室，主要包括以下幾方面：①敏感性，100％為5分，98％～100％為3分，<98%為0分；②特異性，>98％為5分，95％～98％為3分，<95％為O分；③反應溫度，室溫反應為3分，非室溫反應為1分；④效期，>1年為5分，6個月～1年為2分，<6個月為1分；⑤每人份價格，≤1美元為3分，>1美元而≤2美元為2分，>2美元為1分；⑥操作簡便性，非常簡便為5分，簡便為3分，不簡便為1分；⑦檢測每人份的操作時間，<10min為3分，10～30min為2分，>30min為1分；⑧是否需要洗板機或攪拌器，不需要為3分，需要為1分；⑨結果判定，若為肉眼讀?。航Y果判定變異度≤3％為5分，結果判定變異度>3％為3分，若為機器讀取為1分；⑩總分，為以上9項得分之和；⑩結論，得分<23為不適用，得分≥23而≤30為適用，得分>30為非常適用。

7．陽轉系列血清檢測結果

將每種待評價試劑對每個血清盤中的每一份系列血清檢測結果列于表中，同時表中列出參比試劑檢測結果，將兩結果做比較，計算出陽轉血清相對敏感性系數(shù)(詳見453頁)，并計算每一試劑檢測所有系列血清所得的相對敏感性系數(shù)均值和95％可信限。

8．HIV-1 O型血清盤檢測結果

若待評價試劑能檢出HIV-l O型樣品，可用HIV-1 O型血清盤對其進行評價，將檢測結果及確證試劑檢測結果作對比，來評價試劑對HIV-1 O型樣品的檢測能力。

9．操作血清盤檢測結果

對于HIV-1 Ag／Ab檢測試劑，還需用由不同滴度抗原和抗體血清組成的操作血清盤對其進行評價，將檢測結果與BBI提供的結果做比較，來評價試劑對不同滴度樣品的檢測能力。

近年來，隨著對HIV研究的不斷深入和實驗室診斷技術不斷發(fā)展，HIV診斷試劑研究工作取得了長足進展，大量新技術、新試劑不斷涌現(xiàn)。WHO對商品化診斷試劑的評價，不僅提供了許多常規(guī)評價指標，如敏感度、特異性等，還對試劑操作簡便性、應用于小實驗室的可行性等進行了評估，為醫(yī)療衛(wèi)生部門選擇試劑提供了依據(jù)，也為診斷試劑的評價提供了很好的參考。