RT-PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系靈敏度優(yōu)化方法：

1. 分離高質(zhì)量RNA：

成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。

2. 使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶：

在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因?yàn)?/span>cDNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。

SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及thermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會(huì)受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強(qiáng)得多。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時(shí)。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。RNaseH- 的逆轉(zhuǎn)錄酶同時(shí)增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一鏈的總產(chǎn)量使用TCA沉淀法計(jì)算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計(jì)數(shù)的方法分析。

3. 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度：

較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對(duì)這些困難模板的擴(kuò)增可以使用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進(jìn)行cDNA合成時(shí)(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。不要在高于60℃時(shí)使用oligo(dT)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動(dòng)合成)。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對(duì)。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會(huì)降低忠實(shí)性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴(kuò)增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會(huì)降低靈敏度，而且，既然單個(gè)酶就可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)就不能用來將cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來。

4. 促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑：

包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。

5. RNaseH處理：

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對(duì)于某些模板，據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會(huì)阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時(shí)，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對(duì)這種困難模板，RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號(hào)。對(duì)于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因?yàn)?/span>95℃保溫的PCR變性步驟一般會(huì)將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。

6. 小量RNA檢測方法的提高：

當(dāng)僅有小量RNA時(shí)，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時(shí)加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對(duì)于小于50mg的組織或106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。

在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙?；?/span>BSA可以增加靈敏度，而且對(duì)于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的 RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)加入 BSA或RNase抑制劑。