無(wú)論是進(jìn)行cDNA合成還是進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可通過(guò)方便的一步法方案進(jìn)行。我們的一步法RT-PCR試劑盒含有dNTP及反轉(zhuǎn)錄酶和熱穩(wěn)定性熱啟動(dòng)DNA聚合酶的混合物，三者存在于佳的反應(yīng)緩沖液中。只需加入您的RNA樣品及基因特異性引物，即可開(kāi)始您的反應(yīng).
 

　　PCR反應(yīng)的影響因素
 

　　變性溫度與時(shí)間：模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不*，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為94℃ 20~30秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，zui高變性溫度不宜超過(guò)95℃。
 

　　退火溫度與時(shí)間：退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45~68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的zui適退火溫度，可根據(jù)引物的(G+C)%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30~60秒，足以使引物與模板之間*結(jié)合，長(zhǎng)時(shí)間退火沒(méi)有必要。
 

　　延伸溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所用聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定，如同樣擴(kuò)增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)，時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。
 

　　PCR試劑盒循環(huán)次數(shù)：可根據(jù)模板DNA的量、擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定20-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
 

　　酶量：50 μL反應(yīng)體系可用0.5-5 U酶，酶量的選擇與模板DNA的量，擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過(guò)多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過(guò)少時(shí)反應(yīng)性能下降。
 

　　模板：模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過(guò)1 μg為宜，因?yàn)榧恿窟^(guò)多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如，使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。
 

　　?引物：引物與模板配對(duì)的長(zhǎng)度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，zui高不宜超過(guò)30個(gè)核苷酸，*長(zhǎng)度為20~24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5’端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的(G+C)%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中(G+C)%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端。如果可能，引物3’端富有GC，這樣退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物經(jīng)過(guò)色譜層析純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-2 μM左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。