一、間接免疫堿性磷酸酶法
    ELISA試劑盒基本原理與HRP-抗體間接法類似，體，將其制備成酶標(biāo)記抗體。其染色步驟如下。
    (1)切片脫蠟至水，PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP標(biāo)記第
    (2)蛋白酶消化或AR(組織抗原的暴露或抗原的修復(fù)，此步視情況而定)。
    (3)滴加正常血清，阻斷20min(減少非特異性背景染色)，吸去多余血清。
    (4)滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗，37℃孵育30～60min或4℃過(guò)夜，PBS洗3min×3次。
    (5)適當(dāng)稀釋的AKP標(biāo)記的二抗37℃孵育30～60min，PBS洗3min×3次。
    (6)加入0．02mol／L(pH9．0)TBS(內(nèi)含lmmol／L咪唑，5mmol／L MgClz)阻
斷內(nèi)源性堿性磷酸酶。
    (7)ELISA試劑盒切片上滴加50—100~1底物溶液(BCIP／NBT)，室溫中濕盒內(nèi)避光顯色30min一48h，顯色30min后鏡下觀察，待陽(yáng)性充分顯示后水洗終止反應(yīng)。
    (8)充分水洗后用核固紅復(fù)染5min，沖洗后系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。
    (9)結(jié)果觀察，背景呈紅色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈紫藍(lán)色。
    注：染色結(jié)果可根據(jù)不同的顯色底物而顯示不同顏色，如用堅(jiān)固紅(FR／AS-MX)產(chǎn)生的底物為玫瑰紅色，用堅(jiān)固藍(lán)(FB／AS-MX)則產(chǎn)物為紫綠色，而B(niǎo)CIP／NBT為紫藍(lán)色。特別要強(qiáng)調(diào)的是，F(xiàn)R／AS-MX和FB／AS-MX底物系統(tǒng)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)產(chǎn)物，能溶于有劑溶，如乙醇、二甲苯，所以不能用樹(shù)膠封片。ELISA試劑盒